Exercice 1
- Helicobacter pylori (P66928)
- Bacillus subtilis (P14949)
- Homo sapiens (P10599)
- Penicillium chrysogenum (P34723)
- Listeria monocytogenes (Q9S386)
- Escherichia coli (P00274)
- Gallus gallus (P08629)
- Mus musculus (P10639)
- Neurospora crassa (P42115)
- Drosophila melanogaster (P47938)
Acquisition des données
Q 1. Pour chacun des dix organismes, faites une recherche sur le web pour savoir à quelle famille il appartient. A la main, avec vos connaissances et les informations fournies par Swissprot, faites une classification rapide. Sauvegarder vos séquences dans un fichier fasta.
Pourquoi avoir choisi la thiorédoxine ? Pour faire une phylogénie, il faut commencer par trouver un critère de classification commun à toutes les espèces concernées. Par exemple, c'est une mauvaise idée de faire une phylogénie incluant des plantes en étudiant le gène qui code la couleur des yeux, ou de faire une phylogénie avec des mammifères à partir d'un gène qui code la forme des nageoires. La thiorédoxine est une protéine que l'on trouve chez tous les organismes vivants, car elle intervient de dans de nombreux processus cellulaires. C'est donc un bon point de départ. Si vous le souhaitez, vous pouvez voir la structure de la thiorédoxine de Escherichia Coli.
Q 3. Réalisez un alignement multiple des 10 séquences avec ClustalW. Sauvegardez le fichier résultat pour l'alignement et ouvrez le avec MEGA qui est installé sur votre poste de travail.
Q 4. Avant de construire une phylogénie, il faut s'assurer de la correction de l'alignement multiple. Pour cela, il est possible de tirer parti de connaissances extérieures sur la fonction des séquences étudiées, en vérifiant par exemple que les domaines connus sont bien alignés. Prosite permet de localiser les sites connus. Lancez-le sur une des séquences de thioredoxine. Vous devez trouver un domaine caractéristique de la famille. Quel est le motif associé à ce domaine ? Vérifiez sur l'alignement que le motif est présent et bien aligné dans toutes les séquences. Cela garantit que l'alignement est pertinent au moins dans cette région.
Une petite remarque : en général, il est également souhaitable de "nettoyer" l'alignement multiple, en supprimant les régions non informatives, celles qui sont mal conservées. Sur cet exemple, comme les séquences sont relativement bien conservées, cela n'est pas nécessaire.
Construction de l'arbre
Il existe plusieurs techniques pour reconstruire un arbre phylogénétique à partir de données moléculaires. Durant l'introduction, nous avons vu les méthodes de parcimonie et les méthodes de distance (comme UPGMA). Pour ce TP, vous allez appliquer une méthode de distance, appelée Neighbor Joining. Neighbor Joining est dans le même esprit que UPGMA. Elle regroupe les séquences deux par deux progressivement à partir de la matrice de distances.
Q 5. Pour construire une phylogénie, il faut préciser plusieurs paramètres
Q 6. Comparez l'arbre avec la classification communément admise que vous avez retracée en début d'exercice.
Q 7. On observe trois espèces qui se distinguent bien des autres. En observant l'alignement multiple, expliquez pourquoi. Expliquez pourquoi les mammifères et le poulet sont regroupés. Au niveau des séquences, qu'est-ce qui différencie le poulet des mammifères ?
Evaluation des résultats
L'arbre que vous venez d'obtenir semble globalement réaliste. Mais il se peut que localement, ou concernant les longueurs des branches, celui-ci ne soit pas correct (la longueur des branches est indicative de l'évolution).
Il est possible de tester la robustesse d'un arbre phylogénétique avec des techniques de bootstrap. L'idée du bootstrap est que si l'on effectue des petits changements sur les données on doit être capable de retrouver le même arbre. Concrètement, à partir de l'alignement multiple initial obtenu avec Clustal, on construit des nouveaux alignements qui sont obtenus en échangeant des colonnes. C'est légitime car les méthodes de reconstruction phylogénétique supposent que les sites évoluent de manière indépendante. Pour chaque nouvel alignement, on construit une matrice des distance, puis l'arbre correspondant.
Q 8. Il est possible de faire une analyse avec bootstrap, en cochant boostrap. Faites un bootstrap avec 50 arbres (pour que le temps de calcul ne soit pas trop long).
Q 9. Combien de fois le groupe poulet-mammifères est-il retrouvé ? Les noeuds auxquels on peut avoir confiance sont ceux ayant une valeur de bootstrap supérieure à 80%. Identifiez ces noeuds sur le premier arbre calculé.